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培养条件

细胞培养所需环境如下：气相为95%空气及5%二氧化碳，适宜的温度为37℃，使用的培养基为MEM，添加10% FBS和1% P/S。

传代方法

在初次传代时，建议使用1:2的比例进行分瓶传代。当细胞生长状态良好，通常在两天后更换培养液。同时，要保证密闭环境以保持细胞活力。

细胞处理步骤

收到细胞后，首先运用75%酒精对细胞瓶进行消毒，然后在超净台内进行无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以便细胞状态稳定。接下来，使用显微镜观察细胞生长情况，并拍摄不同倍数的照片，前三天的照片作为重要的售后依据，不提供照片将默认收到状态良好。

贴壁细胞传代步骤

1. 弃去培养上清，使用不含钙、镁离子的PBS对细胞进行1-2次润洗。

2. 添加约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液，放置在37℃培养箱中消化1-2分钟。观察细胞是否大部分变圆并脱落，然后迅速轻敲培养瓶，最后添加5ml以上的完全培养基以终止消化。

3. 吹打细胞使其完全脱落后，转移至15ml的离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清液，并补加1-2ml完全培养基进行重悬。

4. 将细胞悬液按1:2的比例分瓶传代（两个T25瓶），并补充新的完全培养基至5-8ml每瓶，最后放入到37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

悬浮细胞传代步骤

1. 实施半换液法处理，垂直放置培养瓶于培养箱中静置1小时，轻轻吸掉3ml培养基后，补充相同体积的完全培养基。如果培养基颜色改变缓慢，可直接添加约500μl的FBS。

2. 离心换液法则是，将细胞悬液收集到离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清，再补加1-2ml培养基进行重悬，并按1:2的比例分到新的T25瓶中。

细胞冻存

在细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃去培养液并用PBS清洗细胞一次。加入约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液，待细胞回缩并变圆后，加入5ml完全培养基终止消化，通过轻轻吹打将细胞脱落，转移至离心管中，1000rpm离心5分钟。

随后，弃去上清，加入1ml的冷冻保存液（例如雅吉生物无血清冻存液，货号：C7001），混匀后装入冻存管。可以将冻存管直接放入-80℃冰箱，若后期转入液氮罐中，则需在-80℃冰箱中存放24小时以上。

细胞复苏

从液氮中取出冻存管，用75%酒精擦拭外壁后，迅速放入37℃水浴中解冻，直至冻存管中无结晶。然后将细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清，沉淀用5ml完全培养基重悬后接种至T25培养瓶，放于37℃,5% CO2细胞培养箱中继续培养。

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